Riboflavin-UVA collagen cross-linking for the treatment of acanthamoeba keratitis
Review Article

核黄素-UVA胶原交联治疗棘阿米巴角膜炎

Choul Yong Park1, Roy S. Chuck2

1Department of Ophthalmology, Dongguk University, Ilsan Hospital, Goyang, South Korea; 2Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Montefiore Medical Center, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY, USA

Contributions: (I) Conception and design: All authors; (II) Administrative support: All authors; (III) Provision of study materials or patients: CY Park; (IV) Collection and assembly of data: CY Park; (V) Data analysis and interpretation: All authors; (VI) Manuscript writing: All authors; (VII) Final approval of manuscript: All authors.

Correspondence to: Choul Yong Park, MD, PhD. Department of Ophthalmology, Dongguk University, Ilsan Hospital, Donggukro 27, Ilsan-dong-gu, Goyang, Gyunggi-do, 10326, South Korea. Email: oph0112@gmail.com.

摘要：在本篇综述中，回顾了近年来核黄素-紫外线A(UVA)胶原交联治疗棘阿米巴角膜炎（AK）的研究进展。通过PubMed搜索引擎(www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)检索关于棘阿米巴、角膜炎、核黄素和胶原交联的英文研究。虽然有大量病例报道核黄素-UVA胶原交联对AK治疗有效，但体内体外的实验研究均未能证明核黄素-UVA对阿米巴及包囊有杀灭作用。综上所述，核黄素-UVA胶原交联治疗AK的疗效仍有争议。有必要进行前瞻性病例对照研究，为临床医生提供明确的指导。

关键词：棘阿米巴；角膜炎；胶原蛋白；紫外线A(UVA)；核黄素；交联

Received: 10 December 2018; Accepted: 26 January 2019; Published: 11 February 2019.

doi: 10.21037/aes.2019.01.06

前言

棘阿米巴角膜炎（acanthamoeba keratitis, AK）最早于1973年在美国和英国报道，是人类角膜最难治的感染性疾病之一[1,2]。AK的发病率差异很大，从美国的0.15/百万到英国的1.5/百万不等[2]。AK最常见的危险因素是使用隐形眼镜、外伤和接触污染的水[2]。特别是在隐形眼镜佩戴率高的国家，超过85%的AK发生在隐形眼镜使用者中[2]。

一般来说，早期诊断和及时给予有效的抗菌药是治疗感染性角膜炎成功的关键。典型的AK是单侧的、且进展缓慢。因此，除非临床医生有敏锐的意识，否则AK的诊断往往会被延误[3,4]。在AK的早期阶段，其临床特征类似于与其他轻度角膜疾病，如点状上皮病变或类似疱疹性角膜炎的假树枝状角膜溃疡[1]。由于抗棘阿米巴药物的毒性非常强，许多人在没有明确诊断的情况下犹豫是否开始治疗。此外，棘阿米巴包囊对抗菌化疗的耐药性是治疗的另一个重要阻碍[1,2,4]。

目前，AK治疗的主流方法是联合使用两种双胍类药物，如0.02%~0.06%的聚六亚甲基双胍（PHMB）和0.02%~0.2%的氯已定[2,4]。双胍类的作用是破坏棘阿米巴的细胞膜和抑制其呼吸酶活性[5]。在欧洲国家，商品化的二脒类滴眼液[0.1%羟乙磺酸丙氧苯脒（商品名Brolene®）可用于治疗AK。二脒类（己脒定和普罗帕脒）的作用机制是通过抑制S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶来干扰棘阿米巴内DNA的合成[6]。

即使采用上述治疗方案，仍有许多AK治疗失败的案例，因此迫切需要新的治疗方案[4]。

核黄素-紫外线A（ultraviolet A, UVA）诱导角膜胶原交联（corneal collagen cross-linking, CXL）已被广泛用于增强各种扩张性角膜疾病的角膜机械强度，如圆锥角膜、透明边缘角膜变性和屈光手术后进行性的角膜扩张[7,8]。此种治疗方案被公认为是一种可以延缓或阻止这些疾病进展的微创方式[8]。

最近的研究发现核黄素-UVA CXL除了可以增强角膜的机械强度，还具有新的治疗作用[9-12]。以往的研究证实核黄素-UVA CXL是治疗对常规局部抗生素治疗无效的感染性角膜炎的有效方法。据报道，难治性真菌性角膜炎和阿米巴角膜炎给予核黄素-UVA CXL治疗后已成功痊愈[11,13]。现在，用于治疗角膜感染的核黄素-UVA CXL被定义为PACK-CXL（用于角膜炎的光活化发色团-CXL）[14,15]。

本文对CXL在AK治疗中作用的体内外证据进行了综述。同时，还提出了未来的研究方向。

核黄素-紫外线CXL治疗感染性角膜炎的机制

核黄素-UVA CXL最初是在20世纪90年代初由德国德累斯大学的研究人员引入。通过一系列光化学反应，如光敏化、光氧化和光聚合，UVA激发核黄素并产生单线态氧，然后通过如咪唑啉酮的产生、触发内源性羰基群以及从核黄素中释放自由基等多种途径促进角膜基质中相邻胶原纤维之间的交联[7]。具体来说，其潜在的光化学反应过程包括有氧（Ⅱ型光化学反应机制）和无氧（Ⅰ型光化学反应机制）两个阶段。核黄素作为光敏剂，被UVA激活为激发单线态或反应性三线态，并与大气中的三重态氧相互作用，产生活性单线态氧（有氧相）。活性单线态氧诱导胶原羰基之间的交联。在厌氧期，缺氧诱导三重态核黄素形成核黄素自由基，如2，3-丁二酮，与角膜基质相互作用，诱导胶原分子间的交联。由于UVA的穿透深度有限，I型胶原纤维直径的典型增宽主要局限于前基质层。

CXL可提高角膜对微生物分泌的蛋白水解酶的抵抗力。CXL对角膜基质的硬化作用增强了角膜组织抵抗酶消化的能力，再加上CXL对微生物的毒性作用，为治疗微生物角膜炎提供了巨大的希望[7]。在大多数报道的顽固性微生物角膜炎病例中，在治疗后几天内角膜溶解即停止进展，避免了紧急的角膜移植。眼科医生之间似乎已经达成共识，即核黄素-UVA CXL是一种新型有效的治疗多重耐药细菌性角膜炎的方法[15]。然而，核黄素-UVA CXL对AK的作用仍有争议。有趣的是，在最近的一项调查中，超过一半(52%)的临床专家回答核黄素-UVA CXL对AK无效，甚至可能是有害的[15]。

CXL的安全性已被广泛研究。UVA对角膜内皮、晶状体和黄斑有毒性。然而，以往的研究表明，核黄素对UVA的吸收可以防止UVA穿透角膜内皮[16]。使用3mW/cm2的UVA和0.1%的核黄素，超过95%的UVA在到达前房之前在角膜内被吸收。角膜对UVA的吸收导致UVA的原辐照度降低了20倍，从3mW/cm2（在角膜表面）降至0.15mW/cm2（在内皮水平），低于被认为对内皮细胞有毒性的阈值0.36mW/cm2[17,18]。

目前已有几种核黄素-UVA CXL治疗方案。CXL的常规德累斯顿方法是在0.1%核黄素溶于20%右旋糖苷溶液中30分钟后，辐照度3mW/cm2或5.4J/ cm2的370nm UVA照射30min[19]。在UVA照射期间，每3-5min在角膜表面滴加一次核黄素溶液。基于本生-罗斯科光化学互易律法则，研究者提出了若干个快速角膜胶原交联方案来作为一种替代疗法。法则里提出在短时间内应用较高的辐照剂量时必须保持相同的光化学效应[20]。

大多数快速角膜交联模式使用9-30mW/cm2的UVA照射3-10分钟来治疗角膜。例如，目前的快速角膜交联模式使用9mW/cm2的辐照度持续10分钟，18mW/cm2持续5分钟，30mW/cm2持续3分钟，以达到与德累斯顿方法相似的效果[20]。

核黄素-紫外线CXL对AK作用的体外证据

体外研究表明，核黄素和UVA联合治疗（3mW/cm2作用30-60min）不能根除棘阿米巴菌株[21-23]。Kashiwabuchi等人在体外实验中未观察到核黄素和UVA联合治疗的抗滋养体（临床分离的棘阿米巴种）的作用，同时在AK动物模型（中国仓鼠模型）中也无临床体征的改善[22]。del Buey等人在以大肠杆菌为食物源的无营养琼脂平板上培养了两种棘阿米巴菌株（棘阿米巴种65和7376）[21]。核黄素和UVA联合处理（5.4和10.8J/cm2，370nm，30或60min）棘阿米巴接种中心区，并检测其存活率。研究发现，在处理24小时后，在距离中心区5mm以上的地方仍能观察到活滋养体和包囊，这表明治疗对阿米巴没有杀灭作用。Berra等人建立AK兔眼模型，采用核黄素-UVA CXL（3mW/cm2，30分钟）治疗[23]。他们发现，接受CXL治疗的兔子与未接受治疗的对照组兔子相比，无明显的临床差异。同时，CXL治疗组的原虫数量甚至高于对照组。

虽然在既往研究中核黄素和UVA联合治疗未能显示出杀阿米巴效应，但另有报道称，在绿光照射下，另一种交联光敏剂玫瑰红表现出良好的效果。Atalay等人将0.1%或0.2%的玫瑰红溶液加到含有棘阿米巴的培养孔中，随后用绿光（523nm，5.4J/cm2）照射。结果发现玫瑰红-绿光CXL能根除66%的棘阿米巴滋养体。核黄素-UVA CXL对照孔则无明显的杀阿米巴作用[24]。

核黄素-UVA CXL治疗AK的临床证据

目前已经发表了许多关于核黄素-UVA CXL治疗细菌性和真菌性角膜炎疗效的报道。在Shetty等人报道的一系列病例中，CXL控制了以往用常规抗菌药治疗的非溃疡性微生物角膜炎[10]。CXL治疗4-6周后，9例细菌性角膜炎患者中的6例和6例真菌性角膜炎患者中的3例完全缓解。这些病例中上皮愈合所需时间为14~28天。他们还报道了CXL术后第一天由于角膜上皮神经丛的刮除，患者的疼痛得已缓解。有趣的是，有时，CXL术后前房积脓增加，积脓消退时间比上皮或基质愈合的时间更长。Said等人研究了核黄素-UVA CXL在晚期感染性角膜炎中的疗效[25]。他们将40只晚期感染性角膜炎眼分为两组:单纯药物治疗组和核黄素-UVA CXL联合药物治疗组。虽然采用CXL不能明显缩短角膜愈合时间，但是核黄素-UVA CXL降低了角膜穿孔和反复感染等并发症的发生率。

虽然有很多关于核黄素-UVA CXL治疗细菌性角膜炎的报道，但有关核黄素-UVA CXL治疗AK的报道却很少。在大多数报道中，常规局部应用双胍类药物治疗顽固性AK，核黄素-UVA CXL则作为辅助治疗。但是在核黄素-UVA CXL术后，仍持续进行局部治疗。因此很难确认CXL的作用。为了清楚地证明核黄素-UVA CXL，有必要对同时使用或不联合使用抗棘阿米巴药物的患者进行对比。此外，在AK 中叠加有细菌感染病例并不少见，所以当抗棘阿米巴治疗的临床效果有限或症状恶化时，应怀疑叠加有细菌感染[26]。

2009年，Ehlers等人首次报道了核黄素-UVA CXL在AK中的临床疗效[27]。应用核黄素-UVA CXL治疗3只眼，2只眼角膜溃疡完全愈合。随后，在2010年Morėn等人报道了核黄素-UVA CXL成功治疗1例AK[28]。虽然他们未通过培养或组织学证实为棘阿米巴感染，但该病例的临床特征显示是AK。即使局部使用PHMB，临床症状也在恶化，因此他们采用用核黄素-UVA CXL (5.4J/cm2)。在治疗后2个月内角膜炎逐渐痊愈。在Morėn等人首次报道后，Khan等人报道了CXL成功治疗的3例AK[13]。之后，Chan等人报道了1例成功治疗的病例[29]。

Price等人对40名感染性角膜炎患者给予365nm UVA（3mW/cm2）照射15~45分钟[11]。病原菌为细菌（24只眼）、真菌（7只眼）、棘阿米巴（2只眼）、病毒（1只眼）和不明生物（6只眼）。6例（细菌2例，真菌3例，1例无生长）经核黄素-UVA CXL治疗后失败，进行了穿透性角膜移植。2例AK患者经核黄素-UVA CXL治疗后痊愈。

Hager等人针对核黄素-UVA CXL杀灭阿米巴的作用提出了一个严肃问题[30]。他们对因难治性AK行穿透性角膜移植后得到的角膜片进行了组织学检查[30]。这些角膜在行穿透性角膜移植前，在接受抗棘阿米巴治疗期间进行了核黄素-UVA CXL（2只眼5.4J/cm2，5只眼32.4J/cm2）。令人惊讶的是，6/7的角膜片在进行核黄素-UVA CXL治疗后，棘阿米巴包囊和滋养体持续存在于角膜组织中。

核黄素-UVA CXL在AK中的未来研究

值得注意的是，不断有关于核黄素-UVA CXL有效治疗AK的报道。然而，很难找到任何能够明确证明核黄素-UVA CXL的杀阿米巴或包囊作用的体外和体内动物研究。人眼对AK有一种免疫反应，这种反应在实验室环境或动物模型中很难复制。人类疾病和实验环境中棘阿米巴载量的差异也可能导致这种差异。

鉴于AK的严重性和棘手性，通过发现任何可能的治疗方案并证明其效果，建立有效和系统的治疗方案非常重要。因此，有必要进行前瞻性病例对照研究，最好采用三组:单独使用局部抗棘阿米巴药物、仅核黄素-UVA CXL，以及联合使用抗棘阿米巴药物和核黄素-UVA CXL。

Acknowledgments

Funding: The study is supported in part by a grant of Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2016R1D1A1B03931724).

Footnote

Provenance and Peer Review: This article was commissioned by the Guest Editors (Roy S. Chuck, Viral V. Juthani and Joann J. Kang) for the series “Refractive Surgery” published in Annals of Eye Science. The article has undergone external peer review.

Conflicts of Interest: Both authors have completed the ICMJE uniform disclosure form (available at http://dx.doi.org/10.21037/aes.2019.01.06). The series “Refractive Surgery” was commissioned by the editorial office without any funding or sponsorship. RSC served as the unpaid Guest Editor of the series. The authors have no other conflicts of interest to declare.

Ethical Statement: The authors are accountable for all aspects of the work in ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Open Access Statement: This is an Open Access article distributed in accordance with the Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 4.0 International License (CC BY-NC-ND 4.0), which permits the non-commercial replication and distribution of the article with the strict proviso that no changes or edits are made and the original work is properly cited (including links to both the formal publication through the relevant DOI and the license). See: https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/.

References

  1. Illingworth CD, Cook SD. Acanthamoeba keratitis. Surv Ophthalmol 1998;42:493-508. [Crossref] [PubMed]
  2. Dart JK, Saw VP, Kilvington S. Acanthamoeba keratitis: diagnosis and treatment update 2009. Am J Ophthalmol 2009;148:487-499.e2. [Crossref] [PubMed]
  3. Claerhout I, Goegebuer A, Van Den Broecke C, et al. Delay in diagnosis and outcome of Acanthamoeba keratitis. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 2004;242:648-53. [Crossref] [PubMed]
  4. Lorenzo-Morales J, Khan NA, Walochnik J. An update on Acanthamoeba keratitis: diagnosis, pathogenesis and treatment. Parasite 2015;22:10. [Crossref] [PubMed]
  5. Larkin DF, Kilvington S, Dart JK. Treatment of Acanthamoeba keratitis with polyhexamethylene biguanide. Ophthalmology 1992;99:185-91. [Crossref] [PubMed]
  6. Siddiqui R, Aqeel Y, Khan NA. The Development of Drugs against Acanthamoeba Infections. Antimicrob Agents Chemother 2016;60:6441-50. [Crossref] [PubMed]
  7. Subasinghe SK, Ogbuehi KC, Dias GJ. Current perspectives on corneal collagen crosslinking (CXL). Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 2018;256:1363-84. [Crossref] [PubMed]
  8. Sorkin N, Varssano D. Corneal collagen crosslinking: a systematic review. Ophthalmologica 2014;232:10-27. [Crossref] [PubMed]
  9. Papaioannou L, Miligkos M, Papathanassiou M. Corneal Collagen Cross-Linking for Infectious Keratitis: A Systematic Review and Meta-Analysis. Cornea 2016;35:62-71. [Crossref] [PubMed]
  10. Shetty R, Nagaraja H, Jayadev C, et al. Collagen crosslinking in the management of advanced non-resolving microbial keratitis. Br J Ophthalmol 2014;98:1033-5. [Crossref] [PubMed]
  11. Price MO, Tenkman LR, Schrier A, et al. Photoactivated riboflavin treatment of infectious keratitis using collagen cross-linking technology. J Refract Surg 2012;28:706-13. [Crossref] [PubMed]
  12. Martins SA, Combs JC, Noguera G, et al. Antimicrobial efficacy of riboflavin/UVA combination (365 nm) in vitro for bacterial and fungal isolates: a potential new treatment for infectious keratitis. Invest Ophthalmol Vis Sci 2008;49:3402-8. [Crossref] [PubMed]
  13. Khan YA, Kashiwabuchi RT, Martins SA, et al. Riboflavin and ultraviolet light a therapy as an adjuvant treatment for medically refractive Acanthamoeba keratitis: report of 3 cases. Ophthalmology 2011;118:324-31. [Crossref] [PubMed]
  14. Hafezi F, Randleman JB. PACK-CXL: defining CXL for infectious keratitis. J Refract Surg 2014;30:438-9. [Crossref] [PubMed]
  15. Hsia YC, Moe CA, Lietman TM, et al. Expert practice patterns and opinions on corneal cross-linking for infectious keratitis. BMJ Open Ophthalmol 2018;3:e000112 [Crossref] [PubMed]
  16. Wollensak G, Aurich H, Wirbelauer C, et al. Significance of the riboflavin film in corneal collagen crosslinking. J Cataract Refract Surg 2010;36:114-20. [Crossref] [PubMed]
  17. Wollensak G, Sporl E, Reber F, et al. Corneal endothelial cytotoxicity of riboflavin/UVA treatment in vitro. Ophthalmic Res 2003;35:324-8. [Crossref] [PubMed]
  18. Wollensak G, Spoerl E, Wilsch M, et al. Endothelial cell damage after riboflavin-ultraviolet-A treatment in the rabbit. J Cataract Refract Surg 2003;29:1786-90. [Crossref] [PubMed]
  19. Wollensak G, Spoerl E, Seiler T. Riboflavin/ultraviolet-a-induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus. Am J Ophthalmol 2003;135:620-7. [Crossref] [PubMed]
  20. Kymionis GD, Kontadakis GA, Hashemi KK. Accelerated versus conventional corneal crosslinking for refractive instability: an update. Curr Opin Ophthalmol 2017;28:343-7. [Crossref] [PubMed]
  21. del Buey MA, Cristobal JA, Casas P, et al. Evaluation of in vitro efficacy of combined riboflavin and ultraviolet a for Acanthamoeba isolates. Am J Ophthalmol 2012;153:399-404. [Crossref] [PubMed]
  22. Kashiwabuchi RT, Carvalho FR, Khan YA, et al. Assessing efficacy of combined riboflavin and UV-A light (365 nm) treatment of Acanthamoeba trophozoites. Invest Ophthalmol Vis Sci 2011;52:9333-8. [Crossref] [PubMed]
  23. Berra M, Galperin G, Boscaro G, et al. Treatment of Acanthamoeba keratitis by corneal cross-linking. Cornea 2013;32:174-8. [Crossref] [PubMed]
  24. Atalay HT, Dogruman-Al F, Sarzhanov F, et al. Effect of Riboflavin/Rose Bengal-Mediated PACK-CXL on Acanthamoeba Trophozoites and Cysts in Vitro. Curr Eye Res 2018;43:1322-5. [Crossref] [PubMed]
  25. Said DG, Elalfy MS, Gatzioufas Z, et al. Collagen cross-linking with photoactivated riboflavin (PACK-CXL) for the treatment of advanced infectious keratitis with corneal melting. Ophthalmology 2014;121:1377-82. [Crossref] [PubMed]
  26. Bacon AS, Frazer DG, Dart JK, et al. A review of 72 consecutive cases of Acanthamoeba keratitis, 1984-1992. Eye 1993;7:719-25. [Crossref] [PubMed]
  27. Ehlers N, Hjortdal J, Nielsen K, et al. Riboflavin-UVA treatment in the management of edema and nonhealing ulcers of the cornea. J Refract Surg 2009;25:S803-6. [Crossref] [PubMed]
  28. Morén H, Malmsjo M, Mortensen J, et al. Riboflavin and ultraviolet a collagen crosslinking of the cornea for the treatment of keratitis. Cornea 2010;29:102-4. [Crossref] [PubMed]
  29. Chan E, Snibson GR, Sullivan L. Treatment of infectious keratitis with riboflavin and ultraviolet-A irradiation. J Cataract Refract Surg 2014;40:1919-25. [Crossref] [PubMed]
  30. Hager T, Hasenfus A, Stachon T, et al. Crosslinking and corneal cryotherapy in acanthamoeba keratitis -- a histological study. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 2016;254:149-53. [Crossref] [PubMed]
  31. Garduño-Vieyra L, Gonzalez-Sanchez CR, Hernandez-Da Mota SE. Ultraviolet-a light and riboflavin therapy for acanthamoeba keratitis: a case report. Case Rep Ophthalmol 2011;2:291-5. [Crossref] [PubMed]
  32. Panda A, Krishna SN, Kumar S. Photo-activated riboflavin therapy of refractory corneal ulcers. Cornea 2012;31:1210-3. [Crossref] [PubMed]
  33. Müller L, Thiel MA, Kipfer-Kauer AI, et al. Corneal cross-linking as supplementary treatment option in melting keratitis: a case series. Klin Monbl Augenheilkd 2012;229:411-5. [Crossref] [PubMed]
  34. Rosetta P, Vinciguerra R, Romano MR, et al. Corneal collagen cross-linking window absorption. Cornea 2013;32:550-4. [Crossref] [PubMed]
  35. Demirci G, Ozdamar A. A case of medication-resistant acanthamoeba keratitis treated by corneal crosslinking in Turkey. Case Rep Ophthalmol Med 2013;2013:608253 [Crossref] [PubMed]
  36. Arance-Gil Á, Gutierrez-Ortega AR, Villa-Collar C, et al. Corneal cross-linking for Acanthamoeba keratitis in an orthokeratology patient after swimming in contaminated water. Cont Lens Anterior Eye 2014;37:224-7. [Crossref] [PubMed]
译者介绍
王春梅。
郑州大学人民医院 河南省人民医院眼科 河南省立眼科医院。硕士研究生在读，本科毕业于新乡医学院临床医学专业，2019年考入郑州大学人民医院眼科学专业，研究方向及范围：眼表疾病与角膜病，目前已获得医师资格证书、执业证书。（更新时间：2021/8/14）

（本译文仅供学术交流，实际内容请以英文原文为准。）

doi: 10.21037/aes.2019.01.06
Cite this article as: Park CY, Chuck RS. Riboflavin-UVA collagen cross-linking for the treatment of acanthamoeba keratitis. Ann Eye Sci 2019;4:7.

Article Options

Download Citation

Share